SKRIPSI UJI TOKSISITAS AKUT DAUN KESUM
UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN KESUM (Polygonum minus Huds) TERHADAP
LARVA Artemia salina Leach DENGAN
METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST
(BSLT)
ACUTE
TOXICITY TEST OF METHANOL EXTRACT OF KESUM LEAVES (Polygonum minus Huds) AGAINST Artemia salina Leach LARVAE USING BRINE SHRIMP LETHALITY TEST METHOD (BSLT)
Hadi Kurniawan*
*) Mahasiswa Program Studi
Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tanjungpura,
Pontianak
ABSTRAK
Daun Kesum (Polygonum minus Huds) merupakan salah satu
kekayaan hayati Kalimantan Barat. Tanaman ini lazim digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional, namun belum ada penelitian untuk meneliti potensi toksisitas akut daun kesum. Tanaman ini mengandung senyawa alkaloid dan flavonoid. Tujuan dari penelitian
ini adalah untuk mengetahui potensi ketoksikan akut ekstrak
metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) terhadap larva Artemia
salina Leach dengan
metode Brine Shrimp Lethality Test
(BSLT) yang ditunjukkan dengan nilai LC50. Penelitian eksperimental ini menggunakan 300 ekor larva udang (Artemia salina Leach) yang dibagi menjadi 5 kelompok kontrol negatif dan 5 kelompok seri
konsentrasi ekstrak, masing-masing terdiri dari 10 ekor larva dengan replikasi 3 kali untuk tiap
kelompok perlakuan. Kelompok perlakuan I (P1) diberi
suspensi sediaan uji ekstrak metanol daun kesum dengan konsentrasi 100 ppm. Kelompok perlakuan II (P2),
diberi suspensi sediaan uji dengan konsentrasi 250 ppm. Kelompok perlakuan III (P3)
diberi suspensi sediaan uji dengan konsentrasi 500 ppm. Kelompok perlakuan IV (P4) diberi suspensi sediaan uji dengan konsentrasi 750 ppm, sedangkan untuk kelompok perlakuan V (P5) diberikan konsentrasi 1000 ppm. Data kematian Artemia
salina Leach dianalisis dengan analisis probit untuk mengetahui nilai LC50. Hasil penelitian ini menunjukkan harga LC50 dari ekstrak metanol daun kesum adalah 137,465 ppm.
Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun kesum memiliki potensi toksisitas akut terhadap larva Artemia salina Leach menurut metode BSLT yang ditunjukkan dengan harga
LC50 < 1000 ppm.
Kata kunci: Uji Toksisitas Akut, Polygonum
minus Huds, Artemia salina Leach,
BSLT, LC50
ABSTRACT
Kesum leaf is one of
biodiversities in West Kalimantan. It has been commonly used by community as traditional herb,
unfortunately there
hasn’t been any research yet to measure its acute toxicity potency. This
plant contains alkaloid and flavonoid compounds. The purpose of this
research is to determine the potency of
acute toxicity of methanol extract of kesum leaves against Artemia
salina Leach larvae using Brine Shrimp Lethality Test method
(BSLT) which is
shown by LC50 value. This research
was done by using 300
brine shrimps
(Artemia salina Leach) were divided into 5 negative control groups,
and 5 treatment groups, which contained 10 larvaes for
each group with 3 times replication group. Treatment group I (P1) is
a suspension which
contained 100 ppm of methanol extract of kesum leaves, P2 group had 250 ppm consentration
and P3 group had 500 ppm, P4
group had 750 ppm and P5 group had 1000
ppm consentration. The
mortality of Artemia salina Leach was analyzed using
probit analysis to know LC50 value. The
result shows
that LC50 value of methanol extract
of kesum leaves
is 137,465 ppm. It means that methanol
extract of kesum leaves had acute toxicity potency against Artemia salina
Leach larva according to BSLT method. It is indicated by LC50 value
< 1000 ppm.
Key words: Acute Toxicity Test, Polygonum minus Huds, Artemia salina Leach, BSLT, LC50
PENDAHULUAN
Dewasa ini, walaupun obat-obat modern telah mendominasi
pelayanan kesehatan formal, penggunaan obat tradisional tetap mendapat tempat
yang penting bahkan terus berkembang. Obat tradisional tidak dapat dipisahkan
dari kehidupan kita karena sudah lekat dengan budaya bangsa dan digunakan oleh
segenap lapisan masyarakat. Sesuai standar mutu dari WHO, obat tradisional
harus memenuhi beberapa persyaratan meliputi kualitas, keamanan, dan khasiat
(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2002), untuk memenuhi persyaratan
tersebut diperlukan upaya penegasan keamanan melalui uji praklinik yang
meliputi uji ketoksikan dan aktivitas, yang jika syaratnya terpenuhi, maka
dapat berlanjut ketahap uji klinik (Setyawati & Suyatna et al., 2007).
Kalimantan
Barat memiliki kekayaan sumber daya alam, diantaranya memiliki tanaman khas
yang biasa digunakan oleh masyarakat Kalimantan Barat baik untuk bahan masakan
maupun obat tradisional. Salah satu kekayaan hayati Kalimantan Barat yang
potensial adalah tanaman kesum (Polygonum minus Huds). Tanaman ini
tersebar di Kalimantan Barat serta dikenal luas oleh masyarakat. Daun kesum
dimanfaatkan sebagai bumbu masakan atau penyedap rasa pada makanan bubur pedas.
Pemanfaatan ini, karena kesum memberikan aroma yang sedap, rasa yang khas, dan nikmat.
Tanaman ini dapat juga dimakan sebagai
lalap. Secara tradisional air rebusan daun kesum digunakan untuk mengobati
masalah pencernaan, menghilangkan ketombe di kepala dan sebagai minuman setelah
bersalin (Wibowo, 2007; Azuan, 2010 & Globinmed, 2010). Mengingat pemanfaatan daun kesum berdasarkan pengalaman secara
turun-temurun, maka perlu didukung oleh informasi ilmiah mengenai potensi
toksisitas akut.
Penelitian uji toksisitas akut ekstrak metanol daun
kesum terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT). Uji toksisitas akut ekstrak metanol daun
kesum ini dipilih mengingat masih kurangnya informasi ilmiah mengenai potensi
toksisitas daun kesum. Metode BSLT dipilih karena metode ini sering
digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam
ekstrak tumbuhan karena sederhana, cepat, murah, mudah, dapat dipercaya, dan hasilnya representatif (Meyer et al.,
1982). Uji
toksisitas dengan menggunakan BSLT ini dapat ditentukan dari jumlah kematian Artemia salina Leach akibat pengaruh
ekstrak atau senyawa bahan alam. Hasil uji dinyatakan sebagai LC50, dinyatakan bersifat toksik/aktif terhadap Artemia salina Leach bila ekstrak tumbuhan tersebut memiliki LC50
< 1000 µg/mL dan berpotensi sitotoksik serta dapat dikembangkan sebagai antikanker (Meyer et al.,
1982). Jika hasil uji BSLT menunjukkan bahwa ekstrak tumbuhan bersifat
toksik maka dapat dikembangkan ke penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi
senyawa sitotoksik tumbuhan sebagai usaha pengembangan obat alternatif
antikanker. Jika hasil uji BSLT menunjukkan bahwa ekstrak tumbuhan tidak
bersifat toksik maka dapat dikembangkan ke penelitian lebih lanjut untuk
meneliti khasiat-khasiat lain dari ekstrak tersebut.
Skrining fitokimia terhadap fraksi metanol daun kesum menunjukkan adanya
senyawa-senyawa golongan flavonoid dan alkaloid. Adanya kandungan golongan
senyawa flavonoid ditunjukkan dengan hasil uji positif dengan pereaksi shinoda
test dan H2SO4, sedangkan adanya senyawa golongan
alkaloid ditunjukkan dengan positifnya hasil uji dengan pereaksi Wagner,
Dragendorf dan Mayer. Hasil penelitian uji antimikroba fraksi metanol dan
dietil-eter daun kesum menunjukkan bahwa kedua fraksi bersifat aktif terhadap
mikroba Bacilus subtilis dan Escherichia coli. Berdasarkan
data uji antimikroba terhadap ekstrak yang diperoleh terhadap bakteri E.
coli dan Basillus subtilis menunjukkan bahwa ekstrak nonpolar mampu
menghambat pertumbuhan kedua bakteri dengan zona hambat masing-masing 1,40 cm
dan 1,85 cm, sedangkan ekstrak polar mampu menghambat pertumbuhan bakteri
dengan zona hambat masing-masing 2,10 cm dan 1,6 cm. Kedua fraksi bersifat
bakteriostatik (Wibowo, 2007).
Penggunaan pelarut metanol pada penelitian ini dikarenakan pada penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh Wibowo (2007),
bahwa sebanyak 2 kg daun
kesum segar yang telah dibersihkan dan diblender kemudian dimaserasi dengan
pelarut metanol selama 2 x 24 jam. Terhadap maserat yang didapat, kemudian
dilakukan fraksinansi dengan dietil-eter, sehingga diperoleh fraksi dietil-eter
dan metanol. Selanjutnya
kedua fraksi dievaporasi hingga diperoleh ekstrak kental masing-masing sebanyak
0,4283 gram fraksi
dietil-eter dan 10,4764 gram
fraksi metanol. Dalam hal ini senyawa yang ditarik lebih banyak pada fraksi
metanol yang mengandung senyawa-senyawa polar daripada fraksi dietil eter yang
mengandung senyawa-senyawa non-polar. Oleh
karena itu, pada penelitian ini digunakan pelarut yang polar khususnya metanol.
Berdasarkan
latar belakang di atas dan karena belum adanya penelitian untuk meneliti
potensi toksisitas akut daun kesum maka penelitian ini diusulkan dengan tujuan
untuk mengetahui potensi ketoksikan akut ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) terhadap larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang ditunjukkan dengan nilai LC50.
METODOLOGI
Alat-alat yang digunakan untuk penelitian ini adalah neraca analitik (Precisa XB 4200 C®, Precisa XT
220 A®), alat stainless, alat-alat gelas (Pyrex®), pipet mikro (Rainin pipet lite SL-100® dan
SL-1000®), rotary evaporator (Heidolph®),
oven (memmert®), hot
plate (Schott Instruments®), desikator, vortex (Maxi Mix II Barnstead
Thermolyne Type 37600 Mixer®), mikroskop (Zeiss Primo Star® dilengkapi kamera dan program Axio Cam), indikator pH, termometer, lampu
pijar/neon 40-60 watt, plat KLT/lempeng silika gel 60 GF254 (E. Merck®), chamber,
pipa kapiler, alat semprot,
dan lampu UV 254 dan 366 nm.
CARA KERJA
Determinasi Tanaman
Determinasi Tanaman
Determinasi bertujuan untuk menetapkan
kebenaran yang berkaitan dengan ciri-ciri morfologi secara makroskopis tanaman daun kesum (Polygonum minus Huds) terhadap kepustakaan. Identifikasi / determinasi
dilakukan di Herbarium Bogoriense, Balai
Penelitian dan Pengembangan Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor.
Preparasi Sampel
Daun kesum diambil di
jalan Mahad Usman, Kelurahan Setapuk Besar, Kecamatan Singkawang Utara, Kota
Singkawang, Provinsi Kalimantan Barat. Penyiapan
bahan ini dilakukan dengan memisahkan daun dari tangkainya, batang, dan akar lalu dibersihkan dari sisa-sisa tanah dan kotoran kemudian dicuci
dengan
air yang bersih dan mengalir. Bagian tumbuhan yang
diambil adalah daun. Kemudian dikeringanginkan di bawah
sinar matahari secara tidak langsung yaitu dengan ditutupi kain hitam lalu
diblender, kemudian
disimpan dalam wadah tertutup. Serbuk daun kering akan digunakan untuk membuat
ekstrak.
Pembuatan
Ekstrak Metanol Daun Kesum (Polygonum
minus Huds) dengan Cara Maserasi
Ekstraksi
dilakukan secara maserasi. Simplisia daun kesum dengan derajat halus yang cocok
sebanyak 600 gram dimasukkan ke dalam bejana kaca/toples, kemudian dituangi dan
direndam dengan 1,4-1,8 L penyari metanol teknis, kemudian ditutup dan
dibiarkan/didiamkan selama 24 jam sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam
pertama, maserat ditampung pada botol kaca, kemudian dimaserasi kembali hingga
5 hari terlindung dari cahaya dan tetap dilakukan pengadukan beberapa kali sehari.
Setelah 5 hari sari diserkai, maserat dikumpul, ampas diperas, disaring dengan
corong Buchner dan diambil filtratnya. Selanjutnya maserat yang masih bercampur
dengan pelarut dievaporasi dengan rotary
evaporator hingga didapatkan ekstrak kental daun kesum. Filtrat dituang
dalam cawan penguap, kemudian diuapkan lebih lanjut pada hot plate. Untuk menghilangkan sisa pelarut metanol sisa residu
diletakkan 24 jam di desikator berisi silika/pengering. Ekstrak kering kemudian ditimbang dan dihitung
kadar dalam persen yang larut dalam metanol/dihitung rendemennya yakni
perbandingan antara ekstrak yang diperoleh terhadap simplisia awal. Ekstrak kering yang diperoleh selanjutnya diuji fitokimia dengan uji reagen
(skrining fitokimia) dilanjutkan dengan uji pemisahan dengan KLT berdasarkan kandungan
golongan senyawa yang positif dari hasil uji reagen, kemudian diuji
toksisitasnya dengan mengunakan larva udang Artemia salina Leach.
Pembuatan Air Laut Buatan (ALB)
Siapkan air laut buatan dengan melarutkan 15 gram NaCl dalam 1 liter aqua® (Harmita & Radji, 2008).
Penyiapan
Kontrol
Kontrol negatif yang digunakan untuk uji toksisitas pada larva udang Artemia salina Leach yaitu dibuat dengan
dimasukkan
pelarut (metanol p.a.) dan dikeringkan, lalu untuk masing-masing vial
ditambahkan 1 mL air laut, 50 µL dimetil sulfoksida (DMSO) 1 % 50 µL, 10 ekor larva udang Artemia salina Leach
dan 1 tetes (50 µL) larutan ragi ke
dalam vial, kemudian ditambahkan air laut buatan sampai volumenya menjadi 5 mL.
Uji Ketoksikan
dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Penetasan Telur Artemia salina Leach
Telur
udang ditetaskan 2 hari sebelum dilakukan uji. Disiapkan bejana untuk
penetasan telur udang. Wadah yang digunakan dibagi menjadi dua bagian, bagian
gelap dan terang kemudian ditambahkan air laut buatan. Satu ruang dalam bejana
tersebut diberi penerangan dengan cahaya lampu pijar/neon 40-60 watt untuk
menghangatkan suhu dalam penetasan agar suhu penetasan 25oC-31oC
tetap terjaga dan merangsang proses
penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut buatan tanpa
penyinaran ditutup dengan aluminium foil atau lakban hitam. Sebelum ditetaskan telur Artemia salina Leach sebanyak 50-150 mg terlebih dahulu
dicuci yakni ditaburkan dan direndam pada wadah berisi akuades selama 1
jam, lalu ditiriskan sampai airnya tuntas, kemudian telur ditempatkan / direndam
pada bagian gelap dari wadah berisi air laut buatan sekitar 300 mL. Telur udang yang terendam air laut buatan
dibiarkan selama 2 x 24 jam sampai menetas menjadi benur (nauplius) yang matang
dan siap digunakan dalam percobaan. Telur akan menetas dalam waktu 18-48 jam dan akan
bergerak secara alamiah menuju daerah terang sehingga larva udang terpisahkan
dari bagian telur atau kulit telur. Larva yang sehat bersifat fototropik dan
siap dijadikan hewan uji setelah berumur 48 jam. Nauplius dipisahkan dari telurnya dengan dipipet
ke dalam beker/vial yang berisi air laut buatan.
Persiapan
Larutan Sampel yang Akan Diuji
Ekstrak yang akan diuji dibuat dalam konsentrasi 0, 100, 250, 500, 750,
1000 ppm dalam air laut buatan.
Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
Vial disediakan untuk
tiap kelompok sesuai peringkat konsentrasi dengan masing-masing disediakan 5
vial dan direplikasi sebanyak 3 kali. Pada uji toksisitas ini dibuat larutan
stok (induk) sebesar 1 % yaitu sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 mL
metanol p.a. Dari stok 1 % diambil volume tertentu untuk membuat seri
konsentrasi sampel sebesar 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL, 750 µg/mL, dan 1000
µg/mL, kemudian vial yang berisi larutan uji dikeringkan sampai semua
pelarutnya menguap selama beberapa hari pada suhu kamar dalam desikator
sehingga tidak berbau pelarut dan dapat
ditunjukkan dengan proses pengeringan menghasilkan penimbangan yang konstan
dengan bobot tetap (Adfa, 2005), kemudian ditambahkan DMSO 1 % 1-3 tetes
(50-150 µL) termasuk vial kontrol untuk melarutkan sampel kembali jika
diperlukan (Kadarisman, 2000; Sutisna, 2000 cit
Atmoko & Ma’ruf, 2009; Adfa, 2007). Selanjutnya
vial yang telah diisi sampel kemudian ditambah air laut buatan 1 mL dan divortex sekitar 30 menit (Indiastuti, 2008),
kemudian 10 ekor larva udang Artemia
salina Leach yang berumur 48 jam dimasukan dalam vial. Satu tetes ragi (0,6
mg/mL) dimasukkan ke dalam setiap vial sebagai makanan Artemia (Harmita & Radji, 2008),
lalu ditambahkan air laut buatan sampai tanda batas volume 5 mL. Kontrol
negatif (blanko) dilakukan cara kerja yang sama tanpa memasukan ekstrak daun
kesum ke dalam vial. Vial-vial
tersebut diletakkan di bawah penerangan. Jumlah Artemia salina Leach yang mati dalam tiap vial selama 24 jam
dihitung dengan cara manual dan mikroskopik. Kriteria standar untuk menilai kematian larva udang adalah bila larva
udang tidak menunjukkan pergerakan selama beberapa detik observasi (Astuti, 2006 cit
Cahyadi, 2009). Cara manual yaitu
dengan mengamati larva di dalam vial dengan bantuan lup, kemudian diamati dalam
kaca arloji dengan bantuan cahaya. Jumlah nauplii yang mati dihitung dengan
mengurangkan jumlah total nauplii pada tiap konsentrasi dengan jumlah nauplii
yang masih hidup. Sedangkan cara mikroskopik adalah dilakukan pengamatan
di bawah mikroskop.
Analisis Toksisitas
Efek
toksik diperoleh dari pengamatan dengan menghitung % kematian (mortalitas)
larva Artemia salina Leach pada tiap konsentrasi. Jumlah Artemia salina Leach yang mati dalam
tiap vial selama 24 jam dihitung. Persen
kematian diperoleh dari hasil perkalian rasio dengan 100%, yaitu larva yang mati dibagi jumlah larva awal dikali 100% untuk tiap replikasi. Lalu
dibandingkan dengan kontrol dan dilakukan analisis hasil sehingga diperoleh
harga LC50.
Apabila pada kontrol ada yang mati, persen kematian ditetapkan dengan rumus
Abbott (Meyer et al., 1982; Harmita & Radji,2008).
Dari
persen kematian, dicari angka/nilai probit tiap kelompok hewan uji melalui
tabel, menentukan log dosis tiap-tiap kelompok kemudian dibuat grafik dengan
persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit vs log konsentrasi, y = bx +
a. Dimana y : angka probit dan x : log konsentrasi, kemudian ditarik garis
dari harga probit 5 (= 50% kematian) menuju sumbu X, didapatkan log
konsentrasi. Log konsentrasi diantilogkan untuk mendapatkan harga LC50 atau LC50 dapat juga dihitung dari persamaan
garis lurus tersebut dengan memasukkan nilai 5 (probit dari 50 % kematian hewan
coba) sebagai y sehingga dihasilkan x sebagai nilai log konsentrasi. LC50
dihitung dan diperoleh dari antilog nilai x tersebut (Priyanto, 2009).
Metode analisis
dilakukan dengan metode manual dan metode program analisis probit. Metode
analisis probit manual menggunakan tabel probit untuk menaksir nilai probit
dengan mengkonversi nilai persen kematian nauplii pada tiap konsentrasi ke nilai probit dalam
tabel dengan mata, lalu regresi dihitung dengan cara manual menggunakan
kalkulator, kemudian sebagai pembanding nilai LC50 dihitung
menggunakan program analisis probit untuk memperkiraan regresi linear dan
mengkonversi persen respon kematian keprobit secara otomatis, selanjutnya
rata-rata nilai LC50 yang diperoleh melalui metode manual dan
program analisis probit dibandingkan apakah berbeda signifikan atau tidak
menggunakan uji dua sampel tidak berhubungan/uji t (Independent Samples T Test) program statistik SPSS 16 for windows.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian
ini menggunakan tanaman kesum
(Polygonum minus Huds) yang
diambil di jalan Mahad Usman,
Kelurahan Setapuk Besar, Kecamatan
Singkawang Utara, Kota Singkawang, Kalimantan Barat. Sampel tanaman terlebih dahulu dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan Pengembangan Botani, Pusat
Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI Bogor. Determinasi tanaman
dilakukan untuk memastikan identitas tanaman yang digunakan
sehingga kesalahan dalam pengambilan tanaman dapat dihindari dan kemurnian bahan
dari tercampurnya dengan tanaman lain dapat terjaga. Berdasarkan surat keterangan dari Pusat Penelitian
Biologi LIPI Bogor nomor 1069/IPH/1.02/If.8/VII/2011 tanggal 21 Juli 2011
menyatakan bahwa hasil identifikasi/determinasi tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kesum jenis Polygonum minus Huds.
Bagian tumbuhan
yang digunakan adalah daun. Daun kesum yang digunakan dalam penelitian ini
adalah dalam bentuk simplisia kering karena kadar air yang lebih sedikit
memudahkan cairan pengekstrak masuk ke dalam sel dan menarik zat aktif yang
terkandung secara sempurna. Simplisia kering yang berwarna
hijau ini dihaluskan menggunakan blender sehingga diperoleh serbuk. Pembuatan serbuk dapat mempermudah
proses ekstraksi.
Ekstraksi yang digunakan yaitu dengan ekstraksi
maserasi. Serbuk kasar simplisia kering daun kesum sebanyak 600 gram diekstraksi dengan teknik maserasi selama 5 hari menggunakan
pelarut/penyari metanol
teknis dengan total pelarut 7 liter.
Selanjutnya rendaman tersebut disimpan terlindung dari cahaya langsung untuk mencegah reaksi yang
dikatalis cahaya atau perubahan warna. Ekstraksi dilakukan selama 5 hari sampai diperoleh filtrat berwarna
pucat. Setelah waktu tersebut, artinya
keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan yang
masuk kedalam cairan telah tercapai dan diharapkan dengan diperolehnya filtrat
yang warnanya pucat senyawa-senyawa
terekstrak secara maksimal.
Pada proses maserasi dilakukan pengadukan berulang atau sesekali diaduk
untuk memaksimalkan penyarian,
sehingga permukaan pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia. Pengadukan
diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar serbuk sampel sehingga
tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecil-kecilnya antara
larutan di dalam dan di luar sel. Pengocokan atau pengadukan dilakukan dengan harapan agar keseimbangan konsentrasi bahan
ekstraksi lebih cepat dalam cairan. Keadaan diam selama maserasi menyebabkan
turunnya perpindahan bahan aktif.
Setelah
melalui proses maserasi didapat hasil dari maserasi atau maserat yang kemudian dilakukan
pemekatan/evaporasi dengan rotary evaporator untuk menguapkan pelarut dan air yang
masih tersisa sehingga didapatkan ekstrak kental dengan berat konstan. Ekstrak
kering yang diperoleh sebanyak
34,18 gram yang berwarna hijau tua,
sehingga diperoleh rendemen 5,7 % (b/b) dari berat sampel segarnya.
Ekstrak daun kesum mengandung senyawa aktif dalam
bentuk metabolit sekunder yaitu flavonoid dan alkaloid. Kandungan flavonoid dan alkaloid ini diuji dengan
skrining fitokimia menggunakan reagen dan uji fitokimia dengan KLT. Hasil
identifikasi kandungan senyawa aktif berdasarkan uji skrining fitokimia dengan
reagen dan KLT pada ekstrak metanol daun kesum, menunjukkan adanya senyawa
alkaloid dan flavonoid.
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan uji
pendahuluan / praskrining aktivitas biologis yang sederhana untuk menentukan
toksisitas suatu senyawa atau ekstrak secara akut dengan menggunakan hewan coba larva udang (Artemia salina nauplii). Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia
salina Leach dengan metode
BSLT ini dapat digunakan
sebagai uji pendahuluan/praskrining
pada penelitian senyawa-senyawa yang
mengarah pada uji aktivitas sitotoksik.
Korelasi antara uji toksisitas akut ini dengan uji sitotoksik adalah
jika mortalitas terhadap Artemia salina Leach yang ditimbulkan memiliki
harga LC50 < 1000 μg/mL
(ppm). Parameter yang ditunjukkan untuk menunjukkan adanya aktivitas
biologi pada suatu senyawa pada Artemia salina Leach adalah jumlah kematian larva udang karena pengaruh pemberian senyawa dengan dosis
yang telah ditentukan. Salah satu organisme yang sangat
sesuai sebagai hewan uji untuk mengetahui bioaktivitas senyawa
melalui uji toksisitas adalah brine shrimp (udang laut) dari
jenis Artemia salina Leach. Uji ini
menggunakan larva udang laut atau nauplii. Beberapa kelebihan
dari uji bioaktivitas dengan brine shrimp lethallity test (BSLT) menggunakan
larva udang Artemia salina Leach adalah cepat waktu ujinya, mudah, tidak memerlukan peralatan khusus, sederhana
(tanpa teknik aseptik), murah (tidak perlu serum hewan), jumlah organisme
banyak, memenuhi kebutuhan validasi statistik dengan sedikit sampel, hasilnya representatif dan dapat
dipercaya (Meyer et al, 1982).
Larutan
ekstrak metanol daun kesum dibuat dengan konsentrasi 100 ppm, 250 ppm, 500 ppm,
750 ppm, dan 1000 ppm serta sebagai pengontrolnya yaitu 0 ppm yaitu hanya pelarutnya tanpa penambahan
ekstrak. Larutan kontrol berfungsi untuk menghilangkan
pengaruh lain diluar ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian nauplius. Pada kontrol negatif hanya digunakan pelarut metanol untuk melihat pengaruh pelarut
terhadap larva udang. Larva udang tidak
ada yang mati disebabkan pelarut metanol telah diuapkan seluruhnya sehingga dalam penelitian ini murni
pengaruh dari ekstrak tanpa dipengaruhi oleh pelarut. Sepuluh larva udang Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan uji toksisitas
dalam setiap konsentrasi masing-masing ekstrak. Perlakuan uji toksisitas ini
dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan / replikasi (triplo) untuk mendapatkan keakuratan data dan data yang didapat baik, sehingga dapat dihitung
secara statistik dari data yang diperoleh.
Jika dilakukan simplo mungkin bisa terjadi kesalahan
dan tidak ada data lain yang dapat dipakai.
Larutan uji dibuat dari larutan induk/stok 1% (10.000
ppm) dengan memipet 50 μL, 125 μL, 250 μL, 375 μL, dan 500 μL ekstrak ke dalam
botol vial. Selanjutnya vial yang berisi larutan uji dikeringkan sampai semua
pelarutnya menguap selama beberapa hari (1 pekan) pada suhu kamar dalam desikator sehingga tidak berbau
pelarut dan dapat ditunjukkan dengan proses
pengeringan menghasilkan penimbangan yang konstan dengan bobot tetap agar
kematian larva tidak dipengaruhi oleh pelarutnya. Kontrol negatif dibuat dengan cara yang sama, yaitu dengan membuat
larutan yang sama kecuali penambahan ekstrak. Larutan kontrol terdiri atas 5 mL air laut yang berisi pelarut metanol, DMSO 1 % 50 µL, 10 ekor larva udang laut dan 1 tetes (50 µL) larutan ragi ke dalam vial. Setelah 24
jam, jumlah larva udang yang mati untuk tiap-tiap konsentrasi dihitung dan
dicatat.
Pelarutan ekstrak dengan air laut sering menimbulkan
masalah karena adanya perbedaan tingkat kepolaran, ekstrak sukar larut dengan air laut sehingga
digunakan DMSO untuk membantu melarutkannya.
DMSO digunakan sebagai surfaktan karena ekstrak tidak dapat larut dalam air
laut. Surfaktan merupakan senyawa yang memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik
sehingga dapat melarutkan ekstrak dengan air laut dengan cara menurunkan tegangan permukaan.
Penggunaan DMSO 1 % sebanyak 1 tetes
(50 μL) berfungsi untuk
membantu kelarutan. Dimetilsulfoksida (DMSO) merupakan cairan tak
berwarna yang memiliki rumus (CH3)2SO merupakan pelarut yang dapat melarutkan senyawa polar maupun non
polar.
Pada prosedur
uji toksisitas pada penelitian ini
digunakan air laut buatan sebagai
media uji. Penggunaan air laut
buatan ini untuk mengkondisikan bahwa air laut yang digunakan tidak terkontaminasi
atau tercemar karena jika menggunakan air laut asli dikhawatirkan terdapat
cemaran atau kontaminasi. Air laut yang digunakan adalah air laut buatan
yang dibuat dengan cara
melarutkan garam ke dalam air mineral.
Air laut buatan dibuat dengan melarutkan 15 gram garam tiap 1 L air. Air yang digunakan untuk melarutkan garam adalah
air mineral Aqua®. Air mineral digunakan karena setelah dilakukan
pra-pengujian pH air laut buatan mendekati pH yang baik untuk pertumbuhan yakni
sekitar pH 6-7 menggunakan indikator pH.
Pada
penelitian ini digunakan 300 ekor larva uji. Rata-rata kematian larva untuk masing-masing kelompok
perlakuan diperoleh dengan menghitung total jumlah kematian setiap kelompok
perlakuan sebanyak 3 replikasi dan kemudian membaginya dengan jumlah replikasi.
Tabel 1. Pengaruh Ekstrak Metanol Daun Kesum (Polygonum
minus Hudz) terhadap Kematian Larva Artemia salina Leach
Kelompok Perlakuan
|
Konsentrasi ekstrak
metanol daun kesum (ppm)
|
Jumlah
Kematian Larva Artemia salina Leach
pada setiap replikasi (Ekor)
|
% Kematian
|
|||
RI
|
RII
|
RIII
|
Rata-rata
|
|||
P1
|
100
|
4
|
5
|
4
|
4,33
|
43,3
|
P2
|
250
|
7
|
8
|
7
|
7,33
|
73,3
|
P3
|
500
|
9
|
9
|
8
|
8,67
|
86,7
|
P4
|
750
|
9
|
10
|
8
|
9
|
90
|
P5
|
1000
|
10
|
10
|
9
|
9,67
|
96,7
|
K
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
Kemudian
untuk mempermudah pengamatan tentang pengaruh berbagai konsentrasi
ekstrak metanol daun kesum terhadap kematian larva Artemia salina Leach dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengaruh Berbagai Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Kesum (Polygonum minus Huds) terhadap Kematian Larva Artemia salina Leach
Berdasarkan grafik di atas didapatkan bahwa
konsentrasi 1.000 ppm
menyebabkan rata-rata kematian larva tertinggi. Sedangkan pada konsentrasi 100
ppm menyebabkan rata-rata kematian larva terendah. Pada kelompok kontrol tidak
didapatkan kematian larva. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak menyebabkan
semakin tinggi jumlah kematian larva. Metode BSLT dilakukan dengan cara
pemaparan larutan ekstrak senyawa yang diuji kepada larva Artemia salina Leach.
Dengan kata lain, larutan ekstrak senyawa tersebut harus larut sempurna dalam
media hidup larva Artemia salina Leach yaitu air laut buatan, sehingga konsentrasi sampel yang
diperoleh menggambarkan konsentrasi sampel yang sebenarnya.
Suatu senyawa dinyatakan mempunyai potensi toksisitas
akut jika mempunyai harga LC50
kurang dari 1000 μg/mL (ppm).
LC50 (Lethal Concentration 50) merupakan konsentrasi zat yang
menyebabkan terjadinya kematian pada 50 % hewan percobaan yaitu larva Artemia
salina Leach. Pengujian
terhadap ekstrak metanol daun
kesum (Polygonum
minus Huds) menunjukkan harga LC50 sebesar 137,465 µg/mL atau ppm. Berdasarkan nilai LC50 yang diperoleh dapat dikatakan ekstrak metanol daun kesum (Polygonum
minus Huds) pada percobaan ini bersifat toksik terhadap Artemia
salina Leach sehingga memiliki potensi toksisitas
akut menurut metode BSLT yaitu pada perlakuan dengan hewan coba larva Artemia
salina Leach. Penelitian Meyer (1982), melaporkan bahwa suatu ekstrak
menunjukkan aktivitas ketoksikan dalam BSLT jika ekstrak dapat menyebabkan
kematian 50% hewan uji pada konsentrasi kurang dari 1000 ppm. Nilai LC50
dari ekstrak metanol yang lebih kecil dari 1000 ppm menunjukkan bahwa ekstrak
tersebut mempunyai potensi sitotoksik
yang dapat dikembangkan sebagai sebagai antikanker. Uji toksisitas terhadap larva udang Artemia
salina Leach atau Brine Shrimp Lethallity Test (BSLT) dapat
digunakan sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarah pada uji
sitotoksik (Meyer et al, 1982).
Selain
menentukan nilai LC50 dengan metode manual, sebagai pembanding hasil
perhitungan maka LC50 juga ditentukan menggunakan program analisis
probit SPSS 16 for windows. Hasil
dari analisis probit dengan menggunakan program probit menunjukkan harga LC50
dari ekstrak metanol daun kesum adalah
125,012 ppm. Untuk mengetahui hubungan antara nilai LC50 dengan metode manual dan
metode program analisis probit maka dilakukan uji statistik. Uji normalitas
dengan metode Shapiro-Wilk disimpulkan bahwa populasi data nilai LC50
metode manual dan nilai LC50 metode program analisis probit terdistribusi normal. Setelah uji normalitas dan uji homogenitas
kemudian selanjutnya dilakukan pengujian statistik parametrik uji dua sampel tidak berhubungan / uji
t (Independent
Samples T Test). Uji t dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan rata-rata
antara dua kelompok sampel yang tidak berhubungan yaitu apakah ada perbedaan nilai LC50
antara metode manual dan program analisis probit. Dari uji t menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan antara rata-rata nilai LC50
metode manual dengan rata-rata nilai LC50 metode program analisis
probit. Berdasarkan hasil
perhitungan dengan metode manual dan metode program analisis probit menunjukkan hasil nilai LC50 rata-rata yang tidak berbeda signifikan yakni 137,465 ppm dengan metode manual dan 125,012 ppm dengan program analisis probit, sehingga dapat
disimpulkan nilai LC50 yang diperoleh benar setelah dihitung dengan 2 metode penghitungan.
Gambar 2. Grafik Konsentrasi vs Probit Tiap
Replikasi
Pada penelitian ini didapatkan bahwa ekstrak metanol daun kesum mempunyai potensi toksisitas akut.
Hal tersebut berkaitan dengan senyawa yang terdapat dalam daun kesum yaitu
alkaloid dan flavonoid, dimana pada kadar tertentu memiliki potensi toksisitas
akut serta dapat menyebabkan kematian larva Artemia salina Leach. Mekanisme
kematian larva diperkirakan berhubungan
dengan fungsi senyawa alkaloid
dan flavonoid dalam daun kesum yang dapat menghambat daya makan larva (antifeedant/pengelak makanan). Cara
kerja senyawa-senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh
karena itu, bila senyawa-senyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat
pencernaannya akan terganggu. Selain itu, senyawa ini menghambat reseptor
perasa pada daerah mulut larva. Hal ini mengakibatkan larva gagal mendapatkan
stimulus rasa sehingga tidak mampu mengenali makanannya sehingga larva mati
kelaparan (Rita, dkk., 2008; Nguyen & Widodo, 1999 cit Cahyadi, 2009).
Fase yang digunakan dalam penelitian ini adalah fase nauplius karena pada saat
itu Artemia berada pada fase yang paling aktif membelah
secara mitosis yang identik dengan sel kanker yang juga membelah secara
mitosis. Hal ini menyebabkan uji BSLT ini sering digunakan sebagai penelitian
pendahuluan dari aktivitas antikanker. Aktivitas sitotoksik adalah aktivitas
yang dapat menyebabkan kematian pada sel (Rang et.al., 2003 cit Kresnamurti, Tanpa tahun). Salah satu mekanisme
kerja obat antikanker juga bersifat sitotoksik yaitu dengan cara menghambat
pertumbuhan sel yang akhirnya menyebabkan kematian pada sel sedangkan
mekanisme aktivitas sitotoksik pada Artemia salina belum diketahui
secara pasti.
Daya toksisitas suatu senyawa dapat diketahui dengan
menghitung jumlah kematian larva Artemia salina dengan parameter lethal
concentration 50 (LC50). Suatu ekstrak dinyatakan bersifat
toksik menurut metode BSLT ini jika memiliki LC50 kurang dari 1000 µg/mL (Meyer, et al.
1982). Hasil uji BSLT
menunjukkan bahwa ekstrak tumbuhan bersifat toksik maka dapat dikembangkan ke
penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi senyawa sitotoksik tumbuhan sebagai
usaha pengembangan obat alternatif antikanker. Pengujian terhadap ekstrak
metanol daun kesum menunjukkan harga LC50
sebesar 137,465
µg/mL atau ppm,
sehingga dapat dikatakan ekstrak metanol daun kesum dalam penelitian ini memiliki aktivitas sitotoksik atau memliki potensi toksisitas
terhadap Artemia salina Leach menurut
metode BSLT karena memiliki LC50 kurang dari 1000 ppm dan
berkolerasi positif sebagai antikanker. Sesuai
penelitian terdahulu yang
menyatakan bahwa apabila suatu ekstrak tanaman bersifat toksik menurut harga LC50
dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat dikembangkan sebagai obat anti
kanker, maka daun kesum dapat
dilanjutkan penelitiannya sebagai obat antikanker di masa yang akan datang. Kandungan senyawa yang berpotensi dalam
ektrak tanaman ini dapat diketahui berdasarkan hasil uji fitokimia/uji kandungan senyawa ekstrak.
Hasil uji kandungan senyawa ekstrak
dengan skrining fitokimia atau dengan reagen dan uji fitokimia dengan KLT
menunjukkan pada ekstrak metanol daun kesum terdapat senyawa alkaloid dan
flavonoid yang diduga berpotensi
sitotoksik namun perlu dilakukan uji lebih lanjut.
KESIMPULAN
1.
LC50 ekstrak metanol
daun kesum (Polygonum minus Huds) adalah
137,465 ppm.
2.
Ekstrak metanol daun kesum (Polygonum minus Huds) memiliki potensi toksisitas akut terhadap Artemia
salina Leach dengan menggunakan metode Brine
Shrimp Lethality Test (BSLT) karena dihasilkan nilai LC50 kurang
dari 1.000 ppm.
3.
LC50 ekstrak metanol daun kesum 137,465 ppm
setara dengan 42,7 gram daun kesum basah.
SARAN
1.
Replikasi sebaiknya dilakukan 5 kali sebagai antisipasi
jika terdapat data pencilan (menyimpang).
2.
Hasil uji pendahuluan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
menunjukkan ekstrak metanol daun kesum memiliki potensi toksisitas akut,
sehingga perlu dilakukan pengujian bioaktivitas lebih lanjut terhadap tanaman
ini.
3.
Perlu
dilakukan penelitian lanjutan mengenai profil metabolit sekunder yang
berpotensi toksik dengan mengisolasi
dan mengidentifikasi senyawa
sitotoksik yang terdapat dalam
tanaman kesum sampai menentukan
struktur molekul/senyawa aktif, kemudian dilakukan uji aktivitas antikanker serta dilakukan standarisasi untuk
dikembangkan menjadi fitofarmaka sebagai usaha pengembangan obat alternatif
antikanker.
DAFTAR
PUSTAKA
Adfa, M., 2005, Survey Etnobotani, Studi Senyawa Flavonoid
dan Uji Brine Shrimp Beberapa Tumbuhan Obat Tradisional Suku Serawai di
Propinsi Bengkulu, Gradien 1 (1): 43, 45-46.
Atmoko, T & A. Ma’ruf, 2009, Uji Toksisitas dan Skrining
Fitokimia Ekstrak Tumbuhan Sumber Pakan Orangutan Terhadap Larva Artemia salina L. Jurnal
Penelitian Hutan dan Konservasi Alam VI (1): 39.
Azuan, 2010,
Kesum:
Polygonum minus Huds, (Online) (http://herba.berita1.com/daun/kesum-polygonum-minus-huds dikunjungi [15 Februari 2011]).
Cahyadi, R., 2009, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Pare (Momordica charantia l.) Terhadap Larva Artemia salina Leach dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST), [Skripsi], Semarang: Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro.
Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, 2000, Parameter
Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan
Obat dan Makanan, hal: 1, 9-11, 13-17.
Globinmed, 2010, Kesum, (Online), (http:
//www.globinmed.com / index.php?option =
com_ content&view =article &
id=79360:kesum&catid=798:k), dikunjungi [9 Maret
2011]).
Harmita
& M. Radji, 2008, Buku Ajar Analisis
Hayati, (Edisi III, Cetakan I), Dalam Manurung J., (Editor), Jakarta: EGC,
hal: 42-43, 48, 76-78.
Indiastuti D.N., et al., 2008, Skrining Pendahuluan Toksisitas Beberapa Tumbuhan Benalu terhadap Larva Udang Artemia salina Leach, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 6 (2): 82.
Kresnamurti, A & T. Budiati, Tanpa Tahun. Perbandingan Uji Sitotoksik CNSL, Asam Anakardat dan Kardol dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test, Fakultas Farmasi Universitas Arilangga Surabaya dan Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya.
Meyer, B.N., et al.,
1982, Brine Shrimp: A Convenient General
Bioassay for Active Plant Constituents, Planta Medica 45: 32-33.
Priyanto,
2009, Toksikologi: mekanisme, terapi
antidotum, dan penilaian resiko, (Cetakan I), Dalam Sunaryo H., (Editor),
Jakarta: Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi, hal: 151-152, 157.
Rita W.S., dkk., 2008.
Isolasi dan Identifikasi
Senyawa yang Berpotensi Sebagai Antitumor Pada
Daging Buah Pare (Momordica charantia L.), Jurusan Kimia FMIPA
Universitas Udayana, Bukit Jimbaran,
Jurnal Kimia Vol. 2.
Setyawati,
A., F.D. Suyatna, et al., 2007, Pengantar Farmakologi: farmakologi dan terapi, (Edisi V),
Dalam Ganiswara S.G., Setiabudi R., Elysabeth, (Editor), Jakarta: Gaya Baru,
hal: 1-24.
Wibowo, M.A., 2007, ‘Uji
Antimikroba Fraksi Metanol dan Dietil-eter Daun Tanaman Kesum (Polygonum cf minus huds)’, (Online), (http://fisika.ub.ac.id/bss-ub/PDF%20FILES/BSS_292_1.pdf,
dikunjungi [26 Februari 2011]), hal 1-6.
Jual kista artemia merk supreme plus dari GSL USA. Tersedia kemasan kaleng isi 15 oz (425 gram) dan kemasan repacking isi 40 gram/botol. untuk informasi dan pemesanan silahkan hub 0812 2841 280. Yanto - Pemalang - Jateng.
ReplyDeleteTerima Kasih
Tersedia juga produk-produk untuk pembenihan udang dan ikan al : Ovaprim, Spirulina, Vitamin C, Multivitamin, Probiotik dll
Thank you so much , sangat membantu dalam melengkapi kata pada skripsi saya
ReplyDelete